初春时节，如果你愿意在北方树林里冒着雪堆前行，你也许会目睹一个奇迹的发生。当浅水池融化又迅速结冰时，一只棕色的小木蛙可能会被冻在冰里，就在水面下几英寸的地方。它蹲伏着，仿佛在准备一个永远无法完成的跳跃，身体被冻得僵硬。它的心跳停止了；呼吸也停止了。但当太阳再次融化池塘时，青蛙也能解冻。它体内的冰融化了，心跳恢复了，血液重新开始循环。它大口呼吸，然后，仿佛数小时或数日的静止生命只是一个小小的麻烦，它就跳走了。
变成一块冰看起来是应对严寒的一种奇怪方式，但对于木蛙和其他一些冷血动物来说，这是一种有效的方式。而且有一天，它对人类也可能有效——至少对人体器官是如此。通过借鉴青蛙进化出的生理策略来在冰冻中生存，许多研究人员认为他们可以找到保存用于移植的人类心脏、肝脏和其他器官的方法。
目前，肾脏只能在高于冰点的 4 摄氏度下，浸泡在含有蛋白质、酶和离子的溶液中保存三天；肝脏最多只能保存 36 小时，而心脏和肺脏很少能保存超过 6 天。如果能将溶液温度降低，这些时间可能会从几小时和几天延长到几个月甚至几年，但尝试冷冻然后解冻人体器官，就像将其拖入生理雷区。器官在冷冻时，冰晶会刺穿并撕裂血管，细胞脱水，它们的膜会塌陷并破裂，从而破坏内部的活性蛋白质。解冻可能更危险。随着温度升高至冰点，冰晶会融合，将细胞挤压到越来越小的空间中，并使其变形。这就是为什么，尽管研究人员在冷冻精子和血细胞等单个细胞，甚至角膜和未成熟胚胎等简单组织方面取得了成功，但冷冻和复原整个器官，以其复杂而脆弱的结构，仍然遥不可及。
但怀着工程师般的信念，一位罗马尼亚出生的科学家 Boris Rubinsky 坚称，如果我们能充分了解冰冻过程的地形，就可以清除这个雷区。为此，十年前，这位生物工程师发明了一种显微镜，用于精细地研究细胞如何冷冻和解冻。凭借他灵敏的仪器，他发现了一种保护哺乳动物器官免受低温致命损伤的新方法。去年，他和他位于加州大学伯克利分校的同事们，借鉴了一系列耐寒动物的经验，成功冷冻了哺乳动物的肝脏六小时并使其复苏。这算不上停止时间的流逝，但无疑是减缓了它。
Rubinsky 在他位于伯克利的生物与热工程实验室里，仔细研究从卵细胞到大鼠肝脏的一切。一扇工业风格的灰色金属门打开，里面堆满了书桌、电脑和液氮罐；在杂乱中，Rubinsky 正在观察他获得专利的低温显微镜。它看起来与普通显微镜很相似，有一个目镜和一个放置载玻片的载物台。这款特殊显微镜的关键在于，载物台的一端连接着一个液氮罐，可以将该端冷却至 -160 摄氏度；另一端则加热至接近体温。一个小马达可以在载物台的两端之间移动载玻片：因此，载玻片的两端温差可以高达 200 度。
今天，Rubinsky 关注的試料是一块正在载玻片上冷冻的血液样本。一台通过显微镜瞄准的摄像机，在几英尺外的电视监视器上记录着这一过程：在载玻片的冷端，不透明的冰指状物在成簇的红细胞中蔓延，像致命的泥石流一样席卷它们，并将细胞压碎在载玻片上。被困在狭窄的冰刀之间的血细胞，有的被拉伸，有的则被撕裂。
但是，当 Rubinsky 添加了甘油溶液以降低载玻片上血液的冰点时，冰晶从尖锐的刀刃状变成了羽毛状的分支。当冰呈现这种形态时，危险性降低了——晶体之间的未冻结通道变大了，而且大多数红细胞完好无损地卡在间隙中。“这是我们学到的秘密之一，”Rubinsky 用他温和的特兰西瓦尼亚口音说道。“细胞的命运很大程度上取决于冰晶的结构。”
关于某种抗冻剂可以保护生物体的知识，可以追溯到 1957 年，当时生理学家 Per Scholander 报告了他前往巴芬岛和拉布拉多的旅行，在那里他“在爱斯基摩人和狗队的帮助下”捕捉到鱼。Scholander 知道这些鱼生活在比它们血液冰点更低的水中，他意识到一定有什么东西阻止了它们结冰，但他无法确定那是什么。十年后，斯坦福大学的一名年轻研究生 Arthur DeVries 研究了他从南极收集的鱼，并发现这种抗冻功能存在于血液的蛋白质部分。几年之内，他就鉴定并纯化了许多这些“抗冻蛋白”。
DeVries 也开始弄清楚抗冻剂是如何工作的。他了解到，这些蛋白质会附着在微小的冰晶上，并在物理上阻碍它们的生长。这些蛋白质只给了鱼额外一度的保护，但这一度却至关重要。“它们通常会在约 -1 摄氏度时结冰，”现任伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的生理学家 DeVries 解释道。“但它们血液中的抗冻蛋白可以将它们保护到约 -2 摄氏度——这是南极洲大陆周围水温。如果它们没有进化出抗冻蛋白，整个南极地区将空无鱼类。”
抗冻蛋白是战胜危险冰晶的一种方式，但并非唯一的方式。1989 年，Rubinsky 将他的低温显微镜带到意大利博洛尼亚大学，帮助以色列兽医 Amir Arav 学习如何使用一种称为玻璃化（vitrification）的过程来保存单细胞猪卵子（oocytes）。玻璃化一种液体，是指将其冷却得如此之快，以至于其分子没有机会组织成构成冰晶的精细晶格。取而代之的是，它们被固定在当时的任意位置，液体变成了一种坚硬但无结构的玻璃状固体。利用 Rubinsky 的仪器，并将卵子浸泡在甘油和其他醇类等保护性化学物质溶液中，Rubinsky 和 Arav 能够精确控制冷却速率，并将卵子冷却到 -130 摄氏度，而没有产生任何可检测到的冰晶；他们还能够观察到在这个过程中发生了什么。不幸的是，与他们之前的人一样，他们看到的是玻璃化过程开始破坏卵子的细胞膜，从而破坏了卵子。
问题在于细胞膜的脂肪磷脂双层。这些磷脂在体温下基本上是液态的。但在极低的温度下，它们会凝胶化，就像冷却的平底锅里的脂肪会凝固一样。在这个从液态到凝胶态的转变（称为脂质相变）过程中，细胞膜暂时失去调节离子和其他化合物进出细胞的能力。后果可能是灾难性的。例如，大多数细胞外的钙浓度比细胞内高约 10,000 倍；但在相变过程中，钙会通过改变的细胞膜大量涌入，从而破坏细胞。
当卵子玻璃化，细胞膜变得危险地渗漏时，Rubinsky 和 Arav 只能坐视不管。然后，Arav 回忆道，“Rubinsky 从口袋里掏出一些白色粉末，说：‘看看我有什么。这是抗冻蛋白。’”
DeVries 给了 Rubinsky 一些从南极鱼中纯化出来的蛋白质样品。“我已经观察到抗冻蛋白可以改变冰晶的结构，”Rubinsky 回忆道。“我想它们可能在引入器官时有益。所以我用抗冻蛋白冷冻了一个肝脏，并观察到膜看起来完好无损。这似乎引发了这样的想法，也许它们也能保存卵子的膜。”
“我们将一些粉末加入玻璃化溶液中，”Arav 说，“在低温显微镜下，我们可以看到细胞膜保持完好无损。”这实际上令人非常惊讶——毕竟，抗冻蛋白通过减缓冰晶生长来发挥作用，但在玻璃化过程中没有晶体可供减缓。Arav 和 Rubinsky 一直工作到深夜来检查他们的结果，测试各种冷却速率并研究细胞膜新的弹性。然后，他们厌倦了工作，去了酒吧。但在他们离开之前，他们将剩余的未冷冻卵子放入抗冻蛋白溶液中，并将其放在实验室的冰箱里，设置为 4 摄氏度。他们这样做并没有真正的原因；毕竟，Arav 说，“没有人曾经通过冷藏保存猪卵子超过两个小时。”但 24 小时后，当他们把卵子从冰箱里拿出来，Arav 在显微镜下观察它们时，发现卵子的膜仍然完好无损。
似乎，那些附着在冷水鱼冰晶上的抗冻蛋白，也能以某种方式附着在细胞膜上，其温度范围既高于也低于冰点。当细胞膜通过其脆弱的相变时，它们似乎会启动。除了减缓冷冻外，抗冻蛋白还能以某种方式加固细胞膜，堵塞孔洞。“这些是了不起的蛋白质，”Rubinsky 说。“它们似乎在能够承受寒冷环境的生物体中发挥着多种重要作用。”
然而，尽管这些蛋白质很重要，它们并非解决问题的唯一方法。虽然它们可以抑制冰晶的形成，但只能在一定温度以下这样做；低于该温度，蛋白质就无法防止冰的侵蚀。冰是由纯水组成的，因此当它形成时，溶解的盐和其他离子会留在细胞外的液体空间中。然后水开始从细胞中扩散出来，直到细胞外溶质的总浓度更接近细胞内。但如果过多的水扩散出来，细胞就会收缩，它们的膜会起皱，细胞内的骨架也会 breakdown。最终，蛋白质会失去使其正常工作的三维结构。此外，冰晶总有刺穿细胞、细胞器或滋养它们的血管的危险。
由于整个冷冻-解冻过程充满了危险，目前移植器官还不能冷冻。因此，器官移植的时间压力常常迫使医生接受供体和受体之间不匹配的组织。“肾脏方面，完全匹配的几率只有大约 5%，”美国红十字会移植实验室器官保存研究负责人 Greg Fahy 说。“尽管其他器官也匹配，但只是不太匹配。对于肝脏和心脏，保存时间太短，我们甚至在移植后才能知道兼容性。不幸的是，在高于冰点的温度下，器官的保存时间不太可能大幅延长。”
Fahy 相信，尽管存在细胞膜渗漏问题，移植的最佳未来将在于玻璃化。他说，通过快速通过水变成冰的温度，达到变成玻璃的温度，玻璃化提供了逃避冰损伤的潜力。在约 -130 摄氏度的温度下，生物时间被真正暂停了。
然而，玻璃化的希望仍然是遥不可及的。器官的玻璃化，不像单细胞卵子的玻璃化，需要致命的高浓度甘油和其他化学物质。这些化学物质会杀死它们试图保护的器官。
因此，当 Rubinsky 尝试冷冻并复苏哺乳动物肝脏时，他没有求助于高科技的玻璃化，而是选择了低技术的木蛙。与渥太华卡尔顿大学的木蛙专家 Kenneth Storey 一起，他首次对木蛙——或任何动物——在冷冻和解冻过程中进行了磁共振成像。
“对我来说，眼见为实，”Rubinsky 说。“我们猜测冷冻过程中发生了什么。MRI 向我们展示了哪些猜测是正确的。”
Storey 已经知道，当一只木蛙结冰时，它的肝脏会产生大量的葡萄糖——一种简单的糖——然后充当血液中的抗冻剂。一只冷冻青蛙全身的葡萄糖水平可以达到人类正常葡萄糖水平的 100 倍。而且这种糖在大脑和其他重要器官（如肝脏和心脏）中的浓度最高。因此，当他们的 MRI 图像显示肝脏、心脏和大脑是身体最后冷冻的部位时，Rubinsky 和 Storey 并没有感到完全惊讶。图像还显示，青蛙是从外向内缓慢冷冻，并从内向外解冻。
“现在我们知道了，这说得通，”Storey 指出。“如果动物的四肢先解冻，它们可能会在心脏和肺部为其提供血液和氧气之前就发生退化。”
也许最重要的是，Rubinsky 的团队清楚地表明，青蛙的生存至少取决于其细胞的部分脱水。正如预期的那样，当细胞膜外形成冰时，细胞开始失水，直到内部溶质浓度与外部液体浓度相匹配。但这就增加了细胞内葡萄糖的浓度，从而阻止了细胞内残留的水结冰。科学家们发现，在冷冻条件下，木蛙失去了细胞中超过 60% 的水分，但细胞内残留的水从未结冰。
现在他认为自己掌握了足够的细节，Rubinsky 准备继续前进。他现在知道，在冷冻哺乳动物器官时，应该逐渐进行，以便给器官细胞足够的时间脱水。而且他知道要使用抗冻剂——鱼类抗冻蛋白来保护细胞膜，以及类似葡萄糖的东西来保护细胞内部。然而，他使用了甘油，因为它更容易通过哺乳动物细胞膜。
为了让甘油有时间渗入所有细胞并保护内部的水分，Rubinsky 知道他必须非常缓慢地将其引入循环系统。因此，他和博士生 Jen-Shin Hong 开发了一个工程师的梦想：一个温度控制的、计算机驱动的自动灌注系统，能够精确控制四个注射泵的压力，以确保在正确的时间将正确剂量的化学物质注入器官。利用这种新设备和一些抗冻蛋白，该团队去年成功冷冻了三个大鼠肝脏，并在六小时后使其复苏。
Rubinsky 不是第一个冷冻哺乳动物器官的人。罗切斯特大学的一个团队在 1991 年冷冻了一个大鼠心脏三个小时。虽然六小时令人印象深刻，但仍然远远短于目前技术可以保存的肝脏的数十小时。当然，Rubinsky 说，他们本可以尝试将肝脏冷冻更长时间，但这并不是重点。“我们实验的重点不是开发最有效的系统，”他说，“而是要看看是否有可能将肝脏从冷冻状态复苏。”
Rubinsky 认为，只需更多的时间和研究——以及对细节的密切关注——人类器官就将能够长期、常规地冷冻。“动物已经进化出多种方式来在极端寒冷的环境中生存，”他说。“我确信，长期器官保存将通过模仿大自然已经设计的策略来实现。”
