癌症研究的肮脏小秘密

在甲状腺癌领域，58岁的肯尼斯·艾因是一位明星。作为肯塔基大学列克星敦分校甲状腺肿瘤学项目的负责人，艾因拥有全国最大的单一医生甲状腺癌诊所之一，并发表了70多篇同行评审论文。直到最近，艾因还因拥有18株珍贵的永生癌细胞系而闻名，这些细胞系是他通过从患者切除的肿瘤中提取组织，并将其小心培养成在小瓶中永生而开发的。世界各地的实验室都依赖“肯塔基艾因甲状腺”或KAT细胞系，以深入了解甲状腺癌的细胞变化，并筛选可能治疗这种每年影响超过6万美国人的疾病的药物。2007年6月，这一切都改变了。艾因出席了在多伦多举行的年度内分泌学会会议，科罗拉多大学医学院内分泌科主任布莱恩·豪根告诉艾因，他的几株最受欢迎的细胞系实际上并非甲状腺癌。豪根的一名研究人员发现，他们实验室储存和研究的许多甲状腺细胞系要么被错误识别，要么被其他癌细胞污染。其中包括艾因的一些细胞系。他们现在正在努力解开这个谜团。

一场灾难正在酝酿——只是尚未官方公布。

艾因感到震惊，这是情有可原的。基于这些虚假细胞系的研究将破坏对不同癌症和可能治疗方法的理解，并用虚假结论充斥科学文献。

“起初我以为可能是他们的样本被污染了，而不是我的，”艾因回忆道。“所以我对我的所有细胞系进行了系统性的解冻和基因分型。”

他发现18株最常共享的KAT细胞系中有17株是冒名顶替者。

艾因弄清问题所在只是时间问题。“在我职业生涯的早期，”艾因说，“加州大学洛杉矶分校放射肿瘤科主任盖伊·朱利亚德创造了一些癌细胞系。他慷慨地与我分享了一些甲状腺细胞系。结果发现，从一开始，那些原始细胞系很可能就是黑色素瘤和结肠癌。”两者都生长迅速，很容易超越生长较慢的甲状腺恶性肿瘤。人为错误——研究人员同时处理两个细胞系，移液管重复使用，两名科学家在工作时共享同一个培养箱或实验室空间——很可能导致了最初的污染，以及随后在艾因和全国其他实验室中被污染的所有细胞系。

但普遍存在的污染并非这个故事的惊人之处。艾因停用了所有细胞系；他再也没有发出过任何一个。他还向14个国家的69位曾收到他细胞系的研究人员发出了信件。他只收到了两份回复。

在不同的癌症研究领域，高达三分之一的细胞系已被确定为冒牌货。然而，这一事实被广泛忽视，这些细胞系仍以其虚假身份继续使用。就在2013年，艾因的一个受污染的细胞系被用于《癌基因》杂志上发表的一篇关于甲状腺癌的论文。“每年大约有10,000篇引用虚假细胞系的论文——新出版物引用或依赖基于冒牌（人类癌症）细胞系的论文，”科罗拉多大学DNA测序分析与核心设施前主任、遗传学家克里斯托弗·科奇说。“这就像一个巨大的牙签金字塔，摇摇欲坠地被欺骗性地粘合在一起。”巴尔的摩约翰霍普金斯彭博公共卫生学院的毒理学家托马斯·哈通对此表示同意：“临床药物试验通常设计得很好。它们失败得太频繁了，因为我们一开始就押错了宝。这是一场灾难。”

就像埃德加·爱伦·坡著名小说《被窃之信》中的信件一样，猖獗的实验室污染问题公之于众，人人可见，并得到了美国国立卫生研究院（NIH）、国家癌症研究所、主要期刊和无数实验室科学家的广泛认可。然而，相关科学家的努力未能遏制这一趋势。

“我现在经常就细胞系污染问题做讲座，”艾因说，“听众中的每一个人都感到震惊和恐惧。但大多数科学家不愿意测试和验证他们的细胞系。NIH不要求这样做。很少有期刊要求这样做。我告诉你，许多科学家即使发现细胞系是假的，也不愿剖析他们的履历。一个有道德的研究人员该怎么办？”

规模过大，不容失败 细胞系是生物学的主力军，常规储存在每个实验室中并进行研究，以了解细胞通路、受体、靶点、激素以及正常和恶性生理学的各个方面。“目前使用的任何一种抗癌药物，都无一例外地首先在培养细胞模型中进行过测试，”NIH分子遗传学家迈克尔·戈特斯曼说。“细胞系是一种永生、组织特异性的生理学试管，”他说。“我们需要精确地知道培养物代表的是哪种细胞。”

当细胞培养物于1907年首次制备时，它们似乎挑战了自然法则。研究人员在由载玻片制成的悬挂装置中，通过营养液将细胞诱导至生命状态。到1943年，科学家们在小鼠中建立了第一个细胞系。

生物学中被研究最多、最珍视的细胞系是HeLa，它于1951年从一位年轻女性Henrietta Lacks的奇怪、柔软、紫色的宫颈癌中培养出来。HeLa细胞系表现出非凡的健壮性。病毒可以在快速生长的HeLa细胞中几天内繁殖百万倍。HeLa使研究人员能够研究脊髓灰质炎、麻疹、乳头瘤病毒（HPV）、艾V和结核病；它被用于创建第一个人鼠细胞杂交体，甚至被送入太空。它在70,000多项研究中发挥了作用。HeLa也很不幸地是常见的细胞系污染物，导致了超过20%的细胞系污染。这并非新闻：首次大规模的HeLa污染于1967年被发现，当时华盛顿大学的遗传学家Stanley Gartler对18种不同的人类细胞系进行了分型。他发现每一个实际上都是HeLa。

HeLa的发现只是个开始。对受污染的食道癌细胞系的研究导致了100多篇科学出版物、11项专利、三项NIH研究资助以及正在进行的涉及癌症患者的临床试验。这些细胞系实际上是肺癌、结肠癌和胃癌细胞。一项备受研究的乳腺癌细胞系被证明是黑色素瘤，根据比利时生物化学家马克·拉克鲁瓦的说法，科学家们认为它代表着一种具有无与伦比转移能力的晚期乳腺癌。而实际上，拉克鲁瓦说，与它真正的黑色素瘤不同，“这种特定的转移行为在乳腺癌进展中很少见。”

暴露风险

揭露受污染细胞系让沃尔特·纳尔逊-里斯付出了职业生涯的代价。他是加州大学伯克利分校培养人类和动物细胞的专家，并在奥克兰经营着一个细胞系库。从1975年到1981年，他在《科学》杂志上发表了一系列文章，揭露了受污染的细胞系并点名了它们的来源实验室。他愤怒的同事们称他的出版物为“黑名单”。在社论中，《自然》杂志主编约翰·马多克斯抨击“自我-

纳尔逊-里斯的工作清楚地表明，HeLa细胞污染远非唯一的问题。最终，NIH终止了他的合同，他与同行如此孤立，以至于离开了科学界，成为一名艺术品经销商。

2007年，一位77岁的退休细胞生物学家罗兰·纳尔多尼决定用生命的最后篇章来结束猖獗的污染。在其他18位细胞生物学专家的支持下，他起草了一份广泛分发的“白皮书”，呼吁结束污染。在联邦研究办公室的最高官员受到惩戒后。

廉正部门向45,000名科学家发出了一封电子邮件，敦促他们检测自己的细胞系，以确保其真实性。

那时，验证细胞系的成本已大幅下降，而检测技术的力量已大幅增加。一种几乎万无一失的DNA指纹技术——短串联重复序列（STR）——即DNA序列在个体间高度可变，因此可用于DNA图谱分析——正日益普及。法医病理学家经常使用该技术对犯罪现场血液中的DNA进行指纹识别。它在实验室科学中以完全相同的方式发挥作用。如果两个细胞系共享相同的STR指纹结果，那么它们确实是相同的。根据化学家约翰·巴特勒（前国家标准与技术研究院组长）的说法，两个细胞系出现相同STR指纹图谱的几率为一亿分之一。“科学家需要追踪指纹的线索，”巴特勒说，“如果结果与你预期不符，那不是指纹识别的问题。那是样本的问题。”

但NIH没有要求对其拨款进行指纹识别，所以一切都没有改变。2009年，时任《自然》杂志执行编辑的免疫学家琳达·米勒发表了一篇未署名社论，抨击资助机构允许细胞系污染继续存在。米勒建议建立一个STR指纹识别细胞系的全球数据库。但她的提议无疾而终。

今天，已知近50年为冒名顶替者的细胞系仍以其假名广泛使用——错误的身份经常在同行评审的出版物中被引用。这怎么可能？ 西西弗斯式的任务 实在太难了。

你如何拆除整个领域的虚假生产线？清理一个普通实验室需要多长时间？好几年。问问丽贝卡·施韦佩吧，她在2006年被内分泌学家豪根招募，加入科罗拉多大学医学院的甲状腺癌研究团队。她的专长是黑色素瘤，黑色素瘤与甲状腺癌有一些共同特征，包括在BRAF基因中备受研究的突变。

施韦佩并不知道她的工作将引发一场足以重塑甲状腺癌领域的雪崩。她刚到不久，就对六种不同的甲状腺癌细胞系进行了实验，但她的结果出奇地干净：三个细胞系给出了一个相同的结果，另外三个细胞系给出了另一个相同的结果。“我当时想，也许我只有两个甲状腺细胞系，而不是六个——其中一些被错误命名，实际上是重复的。”

施韦佩随后向大学DNA测序中心的遗传学家科奇求助。科奇痴迷于细胞系污染。这位70岁的瑞典人，银发、修剪整齐的胡须和温和的五官，自2000年以来已帮助揭露了78多名冒名顶替者。

科奇对施韦佩的细胞系进行了指纹识别，发现确实只有两个。施韦佩和豪根担心污染可能发生在他们的实验室，于是请同事们送来一批同样的六个细胞系。“结果它们与我们的两个细胞系相同，”因此是假的，施韦佩说。

但没有人知道这些细胞到底是什么，因为指纹识别无法告诉科学家细胞的来源。如果没有原始组织样本与细胞进行比较，施韦佩和豪根的神秘细胞的来源可能永远无法确定。人们只能通过在线数据库仔细查找，将它们的STR条形码与数千个已经进行过指纹识别的条形码进行比较，希望能找到匹配。

施韦佩开始搜索美国组织培养收藏（ATCC）数据库，该数据库包含近1200个已进行指纹识别的人体细胞系，包括来自组织、器官和肿瘤的正常和恶性细胞系。这就像试图找到一个消失在证人保护计划中的人一样令人神经紧张。

“一个星期五午夜，”施韦佩说，“在我丈夫和孩子们睡着很久之后，我又一次坐在电脑前，搜索数据库，发现了一个与我们其中一个细胞系匹配的结果。”ATCC将其称为乳腺癌，但STR指纹识别显示这些细胞实际上是黑色素瘤细胞。它们与施韦佩的三个虚假甲状腺癌细胞系完全匹配。

那么这重要吗？是的。这些虚假细胞系被用于两种药物的早期试验，这两种药物后来在甲状腺癌患者身上进行了测试。根据科罗拉多大学医学院肿瘤学家约书亚·克洛珀（该研究的主要作者）的说法，其中一种名为贝沙罗汀的药物，在17名患者一年后没有显着益处。“我不确定我们是否会更早地进行试验，如果我们更早发现真相的话，”他说。

另一种研究药物，维莫非尼，也失败了；甲状腺癌患者通常对该药具有耐药性。“如果我们仍然使用黑色素瘤细胞系，并认为它们是甲状腺癌，”施韦佩说，“我们就不会知道为什么甲状腺癌患者在临床上没有反应。” 一半是假的 施韦佩和她的同事们对剩余的甲状腺癌细胞系进行了指纹识别。2008年秋，他们报告说，40种广泛使用的细胞系中有17种是冒牌货。在他们整理结果的那些年里，施韦佩会 предупрежда其他科学家，如果她知道他们正在研究虚假细胞系。但直到她的团队的结果出现在同行评审期刊上，才很难将消息传开。她甚至曾担任使用虚假细胞系论文的审稿人，但一言不发。“我讨厌这样，”她回忆道。

她和实验室随后获得了一百万美元拨款的一部分，用于鉴定剩余的优质细胞系，并从甲状腺肿瘤中建立新的细胞系。“创建一个新的细胞系非常困难，”施韦佩说。“我们为此工作了两年，只生产了两个新的细胞系。”

当德克萨斯大学MD安德森癌症中心头颈癌外科医生杰弗里·迈尔斯读到她的论文时，他意识到自己也曾发表过关于其中一个虚假细胞系的论文。迈尔斯花了三年时间清理自己的实验室。“我把我们所有的细胞系都送去做指纹识别。我的首席技术员梅·赵花了三年的职业生涯，除了解冻细胞系库存和送DNA样本去做指纹识别之外，什么也没做。”迈尔斯扔掉了4000个小瓶，污染导致50个细胞系退役。“我们用来自其原始来源实验室的70多个新的头颈部细胞系重建并进行了整个库存的指纹识别，”赵说。

即使在那时，在一个完全干净、高度专注于精细技术的实验室里，2013年又发生了新的污染——迈尔斯发现几种不同的细胞系显示出完全相同的突变。污染的原因仍然是个谜。赵认为最可能的可能性是标签错误或交叉污染。“我很震惊地得知，即使在严密监控下，污染也可能发生。科学家需要开发标准和可靠的方法来从根本上解决这些问题，”赵说。

迈尔斯认为污染是科学不可避免的一部分，就像错误和并发症是临床医学不可避免的一部分一样。“每个人都认为，‘我们的实验室不邋遢，所以不会发生什么。’但每个实验室都会发生错误。我们的领域需要建立检查清单，并张贴在实验室里，确保每个人都遵守。”

如今，MD安德森敦促所有科学家在新的细胞系到达实验室后，在发布任何数据之前，立即对其进行指纹识别，并每年对实验室中的所有细胞系进行重新验证。一些大学和中心拥有自己的测序设施；其他则将细胞系发送给承包商，每个样本收费30至80美元。结果几天内就能回来。 障眼法

2012年，科奇作为主要作者发表了一篇论文，揭露了19个虚假的子宫内膜和卵巢细胞系。其中两个子宫内膜虚假细胞系曾备受珍视，因为它们据称取自正常组织，这对于研究恶性转化最早的步骤可能具有无价的价值——潜在地有助于预防癌症。

一旦指纹识别揭示了细胞系的真实来源，例如HeLa，科学家有时会声称他们的细胞系表现或看起来不像HeLa（或黑色素瘤、结肠癌，或任何侵入他们细胞系的细胞）。“人们对待他们的细胞系就像对待宠物一样，”60年代揭露HeLa污染的加特勒说。“他们觉得只要通过显微镜观察，就能凭肉眼识别他们的细胞。”

但STR指纹识别不会说谎。“这个工具极其强大和精确。它是决定性的，”他说。“如果指纹识别显示它是HeLa，它就是HeLa。毋庸置疑。”

伦敦大学学院实验病理学家约翰·马斯特斯讲述了一个正常内皮细胞系被证实是膀胱癌的故事，但研究人员仍然称其为“内皮样”，以便在研究中使用。（内皮细胞是血管和淋巴管内壁的细胞。）“他们清楚地知道这些不是内皮细胞，但为了回避这个问题，不承认它们是膀胱癌细胞，他们称它们为‘内皮样’。我不知道他们如何协调这种障眼法，”马斯特斯说，“这超出了我的理解。”

科奇认为，一些犹豫不决的科学家确实是无辜的：他们实际上不了解指纹识别技术。他还认为，他们过于迷恋细胞行为和功能测试。正如科奇所指出的，细胞在塑料上生长并经过化学操作时，其外观和功能会发生变化。它们也可能在不同实验室多年培养 successive generations 的过程中发生突变。行为并不能证明起源。

声誉受损

2005年，马尼托巴大学微生物学家托马斯·克洛尼什建立了一个备受推崇的“正常”子宫内膜细胞系 hTERT-EEC。这是一个新颖的细胞系，用于研究雌激素和黄体酮在子宫内膜（或子宫内膜）中的作用——包括它们在子宫内膜异位症、流产和癌症中的作用。“我们希望，”克洛尼什说，“研究人员可以使用它们来深入了解生殖生物学和子宫内膜癌演变的重要方面。”

三年后，科奇的同事，研究妇科癌症的分子生物学家安迪·布拉德福德，订购了该细胞系的三份样本。他习惯性地将它们送给科奇进行指纹识别。“当它们被证实是乳腺癌细胞时，我非常失望，”布拉德福德说。“有时真相令人沮丧！”他向克洛尼什要了另一批，希望也许是他自己的实验室污染了第一批。但克洛尼什寄来的新样本也是乳腺癌细胞。在那之后，科奇和布拉德福德说，反复发给克洛尼什的电子邮件都没有得到回复。在此期间，至少有三个国家的研究小组无意中研究并发表了关于该细胞系的论文。

克洛尼什努力解释他为什么没有立即自行支付指纹识别费用。他说，一个原因是成本。当时，费用在67美元到475美元之间。“我提出将他们的样本作为盲样进行分析，并将身份信息发送给一个中立的‘仲裁员’，”科奇说。

克洛尼什觉得他有一个合理的替代方案。“我们进行了非常广泛的功能测试，我们的数据似乎与布拉德福德博士的相矛盾。我们细胞系的独特性意味着利害攸关。而且我们的细胞系似乎不像乳腺癌。”

科学家怎么会如此轻易地被细胞的行为所蒙骗呢？“这就像在不同环境中抚养同卵双胞胎的概念，”布拉德福德说。“他们会看起来和行为不同，但他们的DNA保持不变。”如果乳腺癌细胞系在克洛尼什的细胞培养早期悄悄地污染了它，它将经历使正常细胞永生化的常规技术（包括应用酶、抗生素和抗生素抗性基因）。唯一会增殖的乳腺癌细胞将经受住所有这些化学操作。它们会表现出与未经处理的乳腺癌细胞不同的功能，因为它们的环境发生了如此彻底的改变。

2012年，科奇、布拉德福德及其同事发表了一篇论文，详细介绍了他们的假细胞系及其乳腺癌来源。到2013年5月，克洛尼什做了一个好科学家必须做的事情：他向相关期刊提供了更正，期刊随后也发表了这些更正。“我的声誉受损，”克洛尼什严肃地说，“我在这领域的所有研究都被叫停了。而我们从未打算造成这一切。” 变革之风

一场针对细胞系科学的全球性纠正已经开始。2012年，科奇、马斯特斯和其他16位科学家组成了国际细胞系认证委员会（ICLAC）。他们同意将STR指纹识别作为认证细胞系的全球标准。该委员会还建立了一个公开数据库（可在iclac.org查阅），其中包含所有已知的假细胞系，目前已超过400个。

最近，美国、德国和日本的四大细胞系储存库计划合并其经STR指纹识别验证的细胞系在线数据库，并将每个指纹转换为可搜索的遗传“条形码”。

截至本文撰写之时，至少有22家期刊现在要求作者提供细胞系鉴定。德国《国际癌症杂志》的副主编诺伯特·富塞尼格指出，自2012年该杂志开始要求鉴定以来，投稿量稳步增加。“我们的影响因子，一个衡量期刊成功的常用指标，也有所提高，”他说。

2013年4月，《自然》杂志发布了更严格的要求，所有作者都必须报告研究细胞系的来源以及这些细胞系最近是否经过验证。

免疫学家琳达·米勒，她在2009年《自然》杂志的社论中呼吁建立一个全球STR指纹识别细胞系数据库，她说：“鼓励社区进行认证，这是第一步，但不是最后一步。最终，它必须成为一项要求。科学，以及流向科学家的资金，取决于公众的信任。”

损害控制

科学诚信比以往任何时候都更加重要，而且不仅限于癌症研究。人们对欺诈性科学论文激增的担忧日益加剧。 • 在过去的10年里，科学论文的撤回量增长了十倍以上，而实际发表量仅增长了44%。——《自然》，2011年 • 负责处理科学不端行为案件的研究诚信办公室，在2012年收到了400多项指控——是20年前平均水平的两倍。 • 2013年10月，《科学》杂志记者约翰·博汉农发表了一篇文章，报道了一项“钓鱼执法”行动。他炮制了一篇充满异常和伦理审批问题的欺诈性科学论文，并将其发送给300多家开放获取的同行评审期刊；超过一半接受了这份虚假手稿。 • 在过去十年中被认为是“里程碑式”研究的53篇论文中，只有6篇经受住了考验并可重复。——肿瘤学家李·埃利斯在2012年3月《自然》杂志上的评论 • “为了成功，今天的科学家往往必须是自我推销的企业家，他们的工作不仅受好奇心驱动，还受个人抱负、政治考量和资金需求的驱动。”——费里克·C·方和阿图罗·卡萨德瓦尔，《感染与免疫》主编 — J.N.

[本文最初以“试错”为标题发表]